《300勇士：帝国崛起》的故事背景设定在希腊的温泉关。温泉关是希腊的一个著名关隘，位于希腊半岛的南端，是连接希腊大陆和伯罗奔尼撒半岛的重要通道。在公元前481年，波斯国王薛西斯一世率领大军远征希腊，与希腊联军在温泉关展开了激烈的战斗。这场战斗是希波战争中的重要战役之一，最终希腊联军在斯巴达国王列奥尼达及其三百勇士的带领下，成功抵御了波斯的进攻，取得了胜利。

在游戏中，玩家将扮演雅典海军之父Themistocles（忒弥斯托克利），与斯巴达勇士们一起，誓死守卫希腊温泉关，并与强大的波斯军团在海上展开殊死搏斗。游戏不仅延续了前作的视觉风格和主题，还在剧情和角色上进行了更深层次的探索。